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RNA提取要经历哪些步骤?

2023-02-14

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RNA提取步骤如下:

1、准备10ml离心管,121℃灭菌20min,烘箱烘干5h,将管道烘干备用;

2、将研钵、研棒、勺子用锡纸包好,200℃烘箱烘干4-6小时,取出烘干的研钵等冷却;

3、将CTAB提取液放入65℃水浴锅中加热开水浴锅65℃;

4、取出10ml离心管,每管加入4mlCTAB溶液,加入80微升基乙醇(2%),编号,每个样品两管提取液;

5、将样品加热到65℃,取出研钵开始准备磨样;

6、磨好的样品每管加1g左右,在漩涡仪上混合均匀(可长一点);

7、一组样品磨好后,再漩涡一次,将5分钟放入65℃水浴锅中。;

8、每管加4ml氯仿:异戊醇(v:v=24:1)在漩涡仪上混合均匀;

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9、15℃,10000rpm,10min;

10、将上清液吸入新管中,加入4ml氯仿/异戊醇,在漩涡仪上混合均匀;

11、15℃,10000rpm,10min;

12、吸上清液(尽量不吸多,保证RNA质量),两管合一管;

13、加1/5体积的12M氯化锂;1/4体积的10M氯化锂。

14、放置4℃冰箱过夜,>12小时

15、第二天,开离心机预冷4℃,开65℃水浴锅,加热SSTE65℃;

16、4℃,10000rpm,30min;

17、将上清液倒掉,轻轻吸出残留的上清液,加入400微升的SSTE;

18、在1.5ml离心管中反复吸气,将液体吸出;

19、在旋涡仪上加入400微升氯仿/异戊醇;

20、10000rpm,5min;(4℃)

21、将上清液吸出,加入新的1.5ml离心管,加入2倍-20℃放置的无水乙醇;

22、上下颠倒混合均匀,-70℃放置30分钟;打开4℃预冷的小离心机,到电泳室做胶;

23、取出-70℃样品;

24、4℃,10000rpm,20min;

25、将上清液倒掉,在离心机中甩掉;

26、吸出残留液体;

27、将沉淀物放在通风柜上晾干;

28、打开紫外线分光光度计,调整到RNA测试方法;

29、DEPC水溶解沉淀,每管加15-20微升,开始准备电泳检测和分光光度计检测;

30、电泳检测:4微升DEPC水+1微升6微升×LoadingBuffer+1微升样品;

31、光度计检测:69微升DEPC水+1微升样品;

32、A260/A280=1.8-2.0

33、电泳结果为两条带:亮度为上条:下条=2条:1

34、搅拌制作注意事项固定液可以使蛋白质变性,不再扩散,所以一定要多换一次;电泳后一定要小心取胶、固定、染色,直到干胶板,防止胶水损坏。