永利澳门6774cm
2023-04-14
公司热点4月7日-8日，永利澳门6774cm受邀参加了中国医药生物技术协会主办的干细胞临床研究研讨会。在大会中永利澳门6774cm的细胞类产品吸引了众多行业专家、客户以及行业同仁们的目光。基于嘉宾们的热烈反馈，永利澳门6774cm在此基础上于4月11日举办了产品卫星宣讲会，更深层次解答了大家的疑问。会议内容干货满满，以下整理会议精粹，以飨读者！
直播概述
一、GMP级MSC无血清培养体系介绍
GMP级间充质干细胞无血清培养基
产品优势：
√成分明确：蛋白种类不超过20种，总含量低于1.5mg/mL，全部为人工重组体系，无人源无动物源。
√连续传代：无需更换培养基即可实现原代分离及高代次传代。
√工业级培养：改善细胞贴壁性能，适合细胞产品的大规模生产及3D培养体系。
GMP级玻璃化细胞冻存液
产品优势：
√成分明确：无蛋白，无血清，无动物源成分，所有成分明确。
√通用性：无DMSO，无细胞毒性物质，安全性高。
√简易性：无需程序降温，可直接投入-80°C，12h后，即可置于液氮中长期冻存。
√成本低：可以常温运输及保存，运输成本大大降低。
二、MSC的原代分离及连续传代工艺要点
◆供者筛选
1、伦理审核。
2、新生儿父母的遗传病史、传染病史、健康状况。
3、知情同意书。
4、血检HBV、HCV、HIV、TP。
◆脐带组织的运送
1、脐带运送液：脐带运送过程中应4°C运输，保存在液体环境中，不可干燥放置。
2、短距离运送（＜6h）可使用DPBS或生理盐水加双抗。
3、长距离运送（6-24h）建议使用完全培养基加双抗。
4、脐带进入实验室后若不处理，应立刻放入4°C条件保存。
◆高效分离脐带原代MSC
1. 将医用剪刀、组织、手术柄、手术刀等器械提前灭菌。
2. 用含25mg/L庆大霉素的DPBS清洗脐带3遍，然后用不含庆大霉素的DPBS清洗脐带至清洗液无血色。
3. 使用剪刀将脐带处理成2cm大小的组织段，每段组织沿带静脉将脐带剪开。
4. 使用组织镊撕去脐带静脉内膜、外皮、两根动脉使华通氏胶充分暴露。
5. 使用手术刀将华通氏胶剪切成边长3-5mm 的小块，每2cm组织段切成的华通氏胶小块接种于一个150mm培养血中，使组织块均匀分布，添加10mL-15mL完全培养基。
6. 24-48h 后，补充完全培养基至30mL。
7. 7天全量换液。
8. 10 天全量换液。
9. 12-14 天收获原代细胞。
◆MSC的连续传代
1. 在显微镜下观察培养的MSC细胞 ，当细胞融合度达到80~90%，即可传代。
2. 在超净台中，收集培养瓶中的培养液，加入10mL DPBS清洗细胞后弃去。
3. 加入适量干细胞温和消化酶常温下消化细胞。
4. 在显微镜下观察到细胞全部收缩变圆，且有少量细胞开始流动时（一般2-5分钟），立即加入温和酶使用
量2倍体积的细胞培养上清或者DPBS稀释细胞悬液。
5. 用移液器轻轻吹打瓶壁上未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞完全分散。
6. 将细胞悬液转移到离心管中，300g离心5 min。弃上清，加入2mL完全培养基重悬细胞，使用台盼蓝染色，
或流式细胞仪等方法计数。
7. 按密度8000cells/cm2 （原代培养基）或10000 cells/cm2（GMP级培养基）重新接种细胞。
8. 将培养瓶置于37℃，5%CO2 ，饱和湿度条件下培养。
三、全新CIK产品性能介绍
全新CIK细胞无血清培养套装
产品优势：
√稳定性：培养14天可获得200倍以上细胞扩增，CD3+ CD56+比例达到30%以上。
√通用性：外周血和脐血来源的CIK均可培养，新鲜样本与冻存样本均可培养，仅需20~30mL血样即可上样培养。
√程序化：培养方式简单易行，细胞状态基本统一，按照推荐流程补液，无需进行细胞计数。
四、免疫细胞培养核心要点
1、为了避免抗凝剂占比过高影响自体血浆的使用，应使脐血中的抗凝剂占比低于30%。
2、每次补液时添加的培养基需预温，用多少取多少，禁止将整瓶培养基预温、禁止反复预温。
3、刚入袋时，一般细胞培养袋大而细胞液体积小，建议将培养袋对折使用，选择合适的底面积培养。
4、培养前期一定不要吹打细胞团（D0-D5），以减少细胞机械损伤。
答疑环节
1、Q:培养间充质干细胞时是否可以用酶解法处理脐带？
A:可以用酶解法处理，但是酶的浓度和消化时间控制不好可能会损伤细胞膜，降低细胞活性，并且操作较植块法更繁琐，增加污染的机会，所以还是建议用植块法。
2、Q:培养间充质干细胞冻存样本和新鲜样本的操作区别是什么？
A:培养冻存样本，其细胞活力和细胞数肯定会受到影响，所以相较于新鲜样本，我们建议提高接种密度。
3、Q:分离单个核细胞时，红细胞掺杂比较多，怎么改善？
A:一般脐血中会存在红细胞掺杂比较多的问题，红细胞会在5～7天时皱缩凋亡，但是它会影响单个核细胞的计数。一般有两个处理方案：1、对脐血下层红色液体，按照1:2的比例采用缓冲液进行稀释；2、取少部分细胞悬液，做红细胞裂解，从而达到对单个核细胞精确计数的目的。
4、Q:补液的时候不计数，如果细胞扩增数量很低，补液过多会对细胞生长有影响吗？
A:永利澳门6774cm的补液方案适用于大多数培养方案，最大程度也仅是1:2补液，有些经验非常老道的用户甚至可以做到1:3或1:4的补液。按照我们的培养体系，几乎没出现过扩增倍数非常低的情况。
5、Q:免疫细胞成团分布，如果不吹打细胞团，会引起细胞老化吗？
A:免疫细胞成团分布是一种非常正常的细胞形态，不吹打不会引起细胞老化。如果细胞团过大，可以在镜下观察，如果细胞团内部呈现一种透亮的状态，说明团块内部营养物质很充足。如果团块呈现出漆黑的状态，此时可以适当考虑把细胞团块吹散。
6、Q:分离单个核细胞白膜层时，升降速度对收集细胞的影响有什么影响？
A:离心机影响细胞收集的因素主要是升降速的稳定性，降速不稳会导致白膜层分离不出来。NK细胞收获时，建议设置为700g 30min，升6降4，国产离心机升1降1。
7、Q:hUC-MSC消化时成片脱落是什么原因？胰蛋白酶0.05%和0.25%推荐哪个浓度？
A:一般有两个原因会引起MSC消化时成片脱落：1.细胞密度太大，消化酶无法渗入细胞与细胞之间的细胞间质中；2、消化酶的消化效力太快。如果使用胰蛋白酶，推荐0.25%的浓度，如果采用无血清体系培养，不建议使用胰蛋白酶，因为这会引入动物源成分。
8、Q:PBMC里的NK冻存复苏后为还能继续扩增吗？
A:免疫类细胞的复苏静默期较长，一次冻存对于细胞质量的影响非常大。培养完成的NK量非常大，经过冻存后较难恢复到新鲜效果，成体NK细胞一般是直接用于临床。
以上就是本次产品卫星宣讲会的精华内容了，您还有其他问题，可以在我们的官网后台留言，我们会第一时间为您解答！
