NK细胞疗法在治疗恶性肿瘤的效果上如此出众，之所以没有被广泛应用起来，和NK细胞培养方法的局限性有脱不开的关系。NK细胞体外培养扩增困难，不论是什么来源的NK细胞，外周血、脐带血或者是干细胞来源，扩增都是目前一个比较大的瓶颈。

当下常用的NK细胞体外扩增方法，主要有以下4种方式：

滋养层体系：一般通过K562细胞或经基因改造的K562细胞诱导扩增NK细胞，这种方法的优点在于细胞扩增活率高、速度快，容易获得高表型的CD56+ NK细胞，纯度高，杀伤性强。但是引入的滋养层细胞为肿瘤细胞，其潜在安全风险难以完全消除，这也会导致这种方式培养的NK细胞产品在药物申报方面获批的难度更大。此外，正常的细胞和肿瘤细胞共培养，将这样的细胞用于治疗回输体内，有很大的伦理风险，患者心理难以接受。

外周血或脐带血PBMC诱导：通过细胞因子诱导PBMC分化成NK细胞，这种方法使用的原本都是体内就有的因子，相当于模拟了体内环境，安全性更高。但是受限于血液样本初始NK比例的不稳定，培养的最终结果可能偏差较大，生产效率比较低，而且培养过程中需消耗大量细胞因子，成本较高。此外，市面上的纯因子培养工艺水平参差不齐，这就导致细胞的纯度可能不够，存在脱靶效应，杀伤效果偏弱。虽然纯因子的培养方法存在诸多问题，但是其安全性足够高，这就使得NK产品申报的获批难度有所降低。因此，纯因子培养法成为了当下主流的NK细胞培养方式。而且随着无血清产品的面世、NK细胞培养试剂的迭代升级，越来越多的企业选择纯因子培养法，这也会进一步促进上游企业研发性能更出色的产品反馈下游应用，从而形成一个良好的正向循环。

NK-92细胞系：NK92细胞是一种无限增殖的细胞系，具有高效的细胞毒性和稳定的免疫特性。NK92细胞更容易获取和扩增，容易培养，但是NK92的缺点也很明显，它对IL-2过于依赖，对人的身体负担很大，而且缺乏CD16的表达，杀伤能力较差，在使用时需要辐照处理、存在致瘤性，在体内存活时间极短。

iPSC或ESC诱导的NK定向分化：通过诱导iPSC或ESC定向分化成NK细胞，这种方法技术壁垒很高，而且iPSC的致瘤性尚未妥善解决，安全性和临床有效性仍需面临监管挑战。如果要应用在临床中，恐怕还有很长一段路要走。